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分光光度计在核酸的定量上也起着重要作用

发表时间：2022-07-06      点击次数：7846
　　分光光度计是指，使单色仪或特殊光源供给的特定波长的单色光通过标准试样和被分析试样，比较两者的光强度分析物质成分的分光器。已经成为现代分子生物实验室的常规仪器。
　　核酸的定量是分光光度计使用频率比较高的功能。可以对可溶于缓冲液中的寡核苷酸、单链、双链DNA和RNA进行定量。核酸最高吸收峰的吸收波长为260nm。由于每个核酸的分子结构不同，因此其换算系数不同。要对不同类型的核酸进行定量，需要预先选择对应的系数。测试后的吸光值经过上述系数的换算，得到了相应的样品浓度。测试前，选择正确的步骤，输入原液和稀释液的体积，然后测试空白液和样品液。但是，实验并不顺利。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的机器，吸光值的漂移越大。
　　事实上，分光光度计的设计原理和工作原理允许吸光值在一定范围内变化。也就是说，仪器有一定的精度和精度。另外，还需要考虑核酸本身的化学性质和溶解核酸的缓冲液的pH、离子浓度等。测试时离子浓度过高时，读取值有时会漂移，因此推荐使用像TE这样pH值恒定、离子浓度低的缓冲液。
　　样品的稀释浓度也是不可忽视的因素：因为样品中不可避免地存在细小的粒子，特别是核酸样品。这些小粒子的存在会干扰测试效果。为了将粒子对检查结果的影响控制在最小限度，核酸的吸光值优选至少大于0.1A，吸光值优选为0.1-1.5A。在这个范围内，粒子的干扰比较小，结果稳定。因此，这意味着样品的浓度不能过低或过高(超出光度计的测试范围)。
　　最后是操作要素。如果混合不充分，吸光值太低，会出现负值。混合液中不能存在气泡。空白液中没有悬浮物。否则，读数漂移会很剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品。不这样做的话，浓度差异太大了；换算系数和样品浓度单位的选择一致；窗户磨损的彩杯不能采用；样品的体积必须达到彩杯所要求的最小体积等，有很多操作事项。
　　除了核酸浓度，分光光度计还同时给出了一些非常重要的比值，代表了样品的纯度。例如，A260/A280之比因为蛋白的吸收峰为280nm，所以用于评价样品的纯度。纯样本比大于1.8(DNA)或2.0)RNA)。比值小于1.8或2.0时，表示有蛋白质或酚类的影响。A230表示样品中存在碳水化合物、多肽、苯酚等污染物，比较纯净的核酸A260/A230之比大于2.0。检测A320溶液的浊度和其他干扰因素。纯样品，A320一般为0。
分光光度计
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